Chromatographie de colonne conventionnelle
2. colonne chromatographique (type de rotation)
3. colonne chromatographique (manuel)
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Description
Paramètres techniques
Chromatographie de colonne conventionnelleutilise la différence de rapport de distribution de différentes substances entre la phase stationnaire et la phase mobile, ou les différentes capacités de rétention des phases fixes par rapport aux différentes substances, pour atteindre la séparation des substances. Lorsque le mélange traverse la colonne chromatographique avec la phase mobile, elle interagira avec la phase stationnaire de la colonne (telle que la dissolution, l'adsorption, etc.). En raison des différences de propriétés et de structures physiques et chimiques de chaque composant dans le mélange, l'ampleur et la résistance de leurs interactions avec la phase stationnaire varient également. Dans la même force motrice, le temps de rétention de chaque composant de la phase stationnaire est différent, de sorte que les composants du mélange s'écoulent de la colonne dans un certain ordre, atteignant la séparation.
Paramètre
Détection de résidus de pesticides
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Nous disons souvent queChromatographie de colonne conventionnelleest en fait une séparation de chromatographie sur colonne, également connue sous le nom de chromatographie de colonne. Il a d'abord été inventé et utilisé par les scientifiques russes en 1903. Il a écrasé une solution de pigments végétaux en poudre de carbonate de calcium et a trouvé différentes bandes de couleurs sur la poudre de carbonate de calcium de haut en bas. En séparant et en extrayant différentes bandes de couleurs, la chlorophylle relativement pure, la lutéine, etc. ont été obtenues.
Après cent ans de développement, cette méthode est devenue relativement mature, et la phase stationnaire est également passée d'une seule poudre de carbonate de calcium à l'alumine (qui peut être divisée en acide, neutre, alcalin), gel de silice, carbone activé, etc. Parmi eux, le gel de silice est le plus couramment utilisé dans la phase inversée et la phase inversée de la phase inversée Gel!
La phase stationnaire (gel de silice) doit généralement être purifiée et activée, et la taille des particules doit être uniforme. En théorie, plus la taille des particules est petite et plus la surface par unité de masse est grande, plus la capacité d'adsorption est élevée et plus l'effet de séparation est élevé.
Cependant, en usage pratique, lorsque les particules de phase fixe sont trop petites, il y a souvent deux situations: la première est qu'elles sont plus légères et flottent facilement dans l'air (le gel de silice ne peut pas être dégradé par le corps humain, et plus il est plus fin, plus il est toxique); Deuxièmement, les petites particules peuvent également entraîner de petites lacunes entre les particules, entraînant un débit de solvant lent et une consommation de temps; Prenant l'exemple du silicone, la plus grande taille utilisée commercialement du silicone est actuellement 200-300 mail.
En termes de méthodes de passage de colonnes, en plus des équipements d'analyse automatique tels que la préparation de la circulation directe, la préparation efficace de phase liquide et les machines de passage des colonnes mentionnées précédemment, le passage de la colonne manuelle est principalement divisé en trois types: passant la colonne de pression atmosphérique, passant la colonne de dépressurisation et passant la colonne de pression.
Parmi eux, la dépressurisation à travers la colonne entraîne une mauvaise efficacité d'adsorption en raison du débit rapide de l'éluant, ce qui entraîne la perte de la plupart du nombre de plateaux et une mauvaise efficacité de séparation. Il convient pour séparer les échantillons avec des plaques TLC relativement ouvertes, en particulier pour les échantillons avec une seule grande impureté polaire du produit; La plupart de son temps est consacré au prétraitement des composés, en supprimant certaines impuretés avant une purification soigneuse. Il convient de noter que l'évaporation du solvant causée par une pression négative pendant l'utilisation peut entraîner la condensation d'un grand nombre de gouttelettes d'eau sur la surface extérieure de la colonne. Les composés sensibles à l'eau ne doivent pas être facilement tentés.
Le passage de la colonne de pression atmosphérique est la méthode de séparation la plus efficace parmi les trois, mais parce que le solvant se déplace souvent trop lentement, même le meilleur effet de séparation peut affecter l'efficacité. Par conséquent, la pression est généralement appliquée à ce moment, ce qui est appelé passage de colonne sous pression; Mais la pression ne doit pas être trop élevée. Généralement, une balle à double chaîne est utilisée pour le fonctionnement manuel, et une pompe à poisson est utilisée pour le fonctionnement automatique. Les deux peuvent être modifiés comme indiqué sur l'image.
Processus de passage à colonne conventionnel:
Les travaux de préparation doivent être bien effectués:
Lors de la sélection d'une colonne, observez s'il y a une planche de ponçage. Pour les colonnes sans planches de ponçage, n'oubliez pas de remplir le fond avec du coton. Le coton ne doit pas être trop épais ou trop mince, tant qu'il peut empêcher le silicone de se détacher. (Le blogueur a directement démantelé un cintre de vêtements et l'a utilisé pour insérer du coton dans la prise sur la prise)
Préparez l'éluant de polarité minimale, la lampe UV (recommandée pour le personnel de laboratoire, le portable, prêt à prendre une photo à tout moment), l'équipement de pression et le rack de tube à essai si nécessaire!
Sélectionnez une colonne appropriée, ajoutez du gel de silicone, faites tremper le gel de silicone et aplatissez-le
La sélection dechromatographie de colonne conventionnelleest très important, et leur taille doit être calculée en fonction de la quantité de produit, qui peut généralement être divisée en:
Quelques milligrammes de colonne (le choix final pour la synthèse totale);
Une colonne de plusieurs dizaines de milligrammes (substrat d'expansion méthodologique);
500 milligrammes à 1 gramme de colonne (en utilisant la méthodologie comme matière première);
Piliers autour de 5 g et échelles plus grandes.
Le rapport le plus courant de diamètre de colonne à hauteur en laboratoire est généralement entre 1: 2,5 et 1:15. La quantité de gel de silice utilisée comme phase stationnaire pendant le chargement de l'échantillon est d'environ 20 à 40 fois celle de l'échantillon. La norme pour la sélection des colonnes doit être basée sur la situation d'escalade de la plaque TLC de votre échantillon. S'il y a beaucoup d'impuretés à proximité, essayez de choisir autant que possible une colonne plus grande, afin que votre échantillon puisse être recouvert d'une petite couche mince (épaisseur recommandée en dessous de 5 mm). Si les impuretés sont éloignées, cette épaisseur peut naturellement être augmentée, mais il n'est pas recommandé que l'épaisseur de votre échantillon dépasse 2 cm, sauf si le produit est simplement lavé.
Beaucoup de gens font une erreur de penser que l'ajout de silicone, même s'il est plus épais sur mon échantillon, peut-il être bien séparé? Cette réponse est négative!
La raison en est que ces personnes n'ont jamais pensé que les échantillons en dessous et au-dessus ne fonctionnaient pas sur la même ligne, donc ils ne pouvaient obtenir que des purs, dont la plupart ont été croisés, sans parler de ceux impurs, gaspillant du temps et des solvants!
C'est aussi pourquoi l'échantillon nécessite un amincissement!
Après avoir sélectionné la colonne, l'ajout de silicone peut être effectué via un entonnoir d'alimentation. En même temps, assurez-vous de porter un masque et d'opérer dans un capot de fumée. La raison de cela ne sera pas élaborée par le blogueur (silicose).
Quant à l'infiltration du gel de silice, le processus recommandé est: Premièrement, placer la colonne de gel de silice avec le gel de silice installé verticalement, aplatir la surface du gel de silice avec votre main, relier le fond de la colonne de gel de silice à une pompe à eau, pomper le gel de silice, puis verser dans l'éluent le moins polaire par-dessus. Lorsque l'éluant est sur le point de fuir, fermez la vanne d'arrêt pour empêcher le solvant d'être pompé dans la pompe à eau.
Ensuite, sous pression, le gel de silicone peut être uniformément trempé en rincelant sept ou huit volumes de colonnes avec la plus petite quantité d'agent en développement.
Échantillon ci-dessus
L'échantillonnage est divisé en échantillonnage humide et échantillonnage sec.
(1) Échantillonnage humide.
La méthode recommandée consiste à utiliser une pipette avec une pointe en caoutchouc pour aspirer l'échantillon, près de la section supérieure du gel de silicone, couler lentement et uniformément l'échantillon jusqu'à ce qu'il couvre une couche, puis arrêtez d'ajouter l'échantillon et appliquez une certaine pression pour immerger la substance huileuse dans la couche de gel de silicone; Immerger la substance huileuse dans la couche de silicone et répéter ce processus plusieurs fois jusqu'à ce que tous les échantillons soient chargés!
Certains nouveaux étudiants peuvent être curieux de savoir pourquoi cette opération est effectuée au lieu de recouvrir l'huile de processus humide comme une substance en même temps?
En fait, cette opération peut réduire la hauteur effective de la couche d'échantillon. À ce stade, la chromatographie sur la colonne a déjà commencé, et les échantillons suivants sont comme des solvants poussant les échantillons précédents pour adsorber et désorber dans le gel de silice.
(2) Quant à l'échantillonnage sec.
Sauf si nécessaire, il n'est pas recommandé. Les échantillons solides sont plus recommandés pour être battus ou cristallisés. "Des méthodes sans scrupules, de l'acétate d'éthyle vs eau, une cristallisation assistée par oscillation à ultrasons de l'huile bouillante élevée" et "partagent une méthode de recristallisation en laboratoire" sont recommandées.
L'échantillonnage sec apporte généralement deux problèmes; D'une part, pendant le processus de mélange des échantillons, la possibilité de réaction entre l'échantillon et le gel de silice augmente en raison de la nécessité d'augmenter la température de l'évaporation rotative; D'un autre côté, le chargement à sec signifie que les adsorbants seront introduits dans la couche d'échantillon, augmentant la hauteur de la couche d'échantillon ou la taille de la colonne, nécessitant plus de temps et plus de solvant.
S'il n'y a pas d'autre choix, versez simplement la poudre adsorbée lentement dans la colonne pour le chargement, avec certaines exigences similaires aux méthodes humides.
Ajouter le sulfate de sodium anhydre ou le sable de quartz
Afin d'éviter d'avoir un impact sur la couche d'échantillon pendant l'ajout d'éluants, provoquant une inégalité, une déformation et une efficacité de séparation, une couche de sulfate de sodium anhydre ou de sable de quartz est généralement posée au-dessus de la couche d'échantillon.
Nos ingénieurs préfèrent personnellement poser du sulfate de sodium anhydre car il a également une fonction de séchage et est convivial pour les solvants tels que le dichlorométhane, qui sont sujets à la volatilisation, à l'absorption de chaleur et à la condensation!
Élution, échantillonnage et collection de gradient
Après le chargement, rincez d'abord la colonne avec un petit solvant polaire (un solvant qui ne permettra pas au produit de passer) pour les volumes de colonnes 2-3 (un volume de colonne est défini comme le volume de la phase mobile coulant dans et hors) pour assurer l'uniformité, puis sélectionner une proportion pour l'élution.
Comment choisir l'éluant qui passe par la colonne?
Le rapport d'Eluent est le rapport lorsque votre produit atteint une valeur RF d'environ 0. 2 sur la plaque TLC
C'est l'expérience du lavage des colonnes que j'ai lu de nombreux livres et partagée, et le processus réel est également très similaire. Personnellement, je préfère réduire deux fois le gradient.
Par exemple, si le solvant pour l'escalade de plaques TLC est PE / EA =2: 1, le blogueur est plus susceptible de commencer l'élution du gradient de PE / EA =4: 1 et de fin à PE / EA =2: 1, ce qui donne généralement de meilleurs résultats.
Il existe également des techniques lors de la collecte d'éluants. Vous pouvez d'abord choisir un tube à essai plus grand pour le recevoir, et lorsque TLC s'approche du point cible, passez à un tube à essai plus petit. Cela peut réduire la possibilité de recevoir plus et d'éviter les impuretés.
Si vous rencontrez des situations où les points d'impureté et les points de produit sont proches les uns des autres, en particulier ceux qui ont une faible fluorescence, n'oubliez pas de ne pas appliquer de pression. Au lieu de cela, choisissez de passer la colonne sous pression normale et modifiez le tube chaque fois que la moitié ou moins les tubes sont connectés, ce qui peut également augmenter la probabilité de purification.
N'oubliez pas de ne pas gérer le pilier en temps opportun!
Beaucoup de gens ont l'habitude de supposer que la colonne a été passé et séchée lorsqu'il n'y a pas de produit dans un ou deux tubes après TLC au stade ultérieur.
J'ai seulement réalisé que le rendement était trop faible lorsque je l'ai calculé, ou lorsque je suis allé faire un spectre, j'ai constaté que le spectre était incorrect et manquait le mauvais point. Je l'ai regretté profondément.
Il est donc recommandé de ne pas vous précipiter pour traiter la colonne après avoir terminé le point souhaité. Au lieu de cela, effectuez une résonance magnétique nucléaire pour correspondre au rendement avant le traitement.
Si vous êtes occupé ou pressé de purifier d'autres composés avec celachromatographie de colonne conventionnelle, il est recommandé de rincer avec un solvant mélangé bénin à haute polarité et de laisser cette partie de l'éluant séparément pour les résultats d'identification.
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