Chromatographie de colonne HPLC
2. colonne chromatographique (type de rotation)
3. colonne chromatographique (manuel)
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Description
Paramètres techniques
Chromatographie de colonne HPLC, également connu sous le nom de chromatographie liquide haute performance (chromatographie liquide haute performance), est une chromatographie liquide à colonne avec une efficacité de séparation élevée, et est également une branche importante de la chromatographie.
Il sépare les composants de l'échantillon en fonction de la différence de force d'adsorption et de coefficient de partition entre la phase fixe et la phase mobile. Sous un système de perfusion à haute pression, une phase mobile (généralement un seul solvant ou un mélange de solvants avec différentes polarités) est pompé dans une colonne contenant une phase stationnaire. Lorsque chaque composant de l'échantillon passe par la colonne de chromatogramme, en raison de la taille et de la résistance différentes de l'interaction avec la phase stationnaire (telle que l'adsorption, la distribution, l'exclusion, l'affinité), le temps de séjour dans la phase stationnaire est également différent, de manière à réaliser la séparation de chaque composant. Les composants séparés entrent ensuite dans le détecteur pour la détection, obtenant ainsi des informations qualitatives et quantitatives de chaque composant.
Paramètre
Applications en analyse pharmaceutique
Application de la chromatographie de la colonne HPLC dans l'analyse des médicaments
En tant que technologie d'analyse de séparation importante, la chromatographie liquide haute performance (HPLC) a montré un grand potentiel d'application et une valeur dans le domaine de l'analyse pharmaceutique depuis son développement rapide dans les années 1970. En combinant les principes de séparation de la chromatographie liquide classique et de la chromatographie en phase gazeuse, le HPLC est devenu un outil indispensable dans l'analyse des médicaments pour sa séparation efficace, son analyse rapide, sa sensibilité de détection excellente et sa large gamme d'applications.
Principes et caractéristiques de base
Il utilise l'interaction des phases fixes et mobiles pour séparer progressivement les différents composants du mélange. La phase stationnaire peut être un solide ou un liquide attaché à un solide, tandis que la phase mobile est un liquide ou un gaz. Dans HPLC, le solvant est forcé à travers la colonne à des pressions élevées jusqu'à des centaines d'atmosphères, améliorant considérablement l'efficacité de séparation. Selon les différents mécanismes de séparation, le HPLC peut être divisé en phase normale HPLC, phase inverse HPLC, échange d'ions HPLC et exclusion de volume HPLC. Chaque type a sa portée d'application et son mécanisme de séparation spécifique, tels que la phase normale HPLC pour séparer les analytes basés sur la polarité, et la phase inverse HPLC pour se séparer en utilisant des interactions hydrophobes.
Les caractéristiques de la chromatographie sur la colonne HPLC se reflètent principalement dans les aspects suivants:
Efficacité de séparation élevée: HPLC permet une séparation efficace des mélanges complexes grâce à des pompes à perfusion à haute pression et à des colonnes à haute performance.
Haute sensibilité: les détecteurs modernes, tels que les détecteurs d'absorption ultraviolette, les détecteurs de fluorescence, les détecteurs de spectrométrie de masse, etc., font que le HPLC a une sensibilité de détection extrêmement élevée.
Large gamme d'applications: le HPLC n'est pas limité par la volatilité et la stabilité thermique de l'échantillon, et peut analyser des substances actives physiologiques thermiques instables avec un point d'ébullition élevé et pas facile à vaporiser.
Degré élevé d'automatisation: La plupart des instruments HPLC modernes sont équipés d'un échantillonneur automatique et d'un processeur de données, qui peuvent réaliser l'automatisation de l'analyse et le traitement rapide des données.
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Application spécifique dans l'analyse des médicaments
Le HPLC peut être utilisé pour l'analyse de la composition des médicaments afin de déterminer les ingrédients actifs et les impuretés nocives des médicaments. Par exemple, par l'analyse des flavonoïdes, des alcaloïdes et d'autres ingrédients actifs dans les matériaux médicinaux chinois, les types et le contenu des ingrédients actifs peuvent être déterminés pour assurer la qualité et l'efficacité des médicaments. De plus, le HPLC peut également être utilisé pour l'analyse de composition de médicament dans les formes posologiques pharmaceutiques occidentales, telles que les injections, les comprimés, les capsules, etc., pour s'assurer que la composition du médicament dans le médicament répond aux exigences spécifiées.
HPLC joue un rôle important dans la détermination de la concentration de médicament. En déterminant précisément la teneur en médicament dans un médicament, la sécurité et l'efficacité du médicament peuvent être assurées. Par exemple, dans l'analyse des médicaments antibiotiques, le HPLC peut être utilisé pour déterminer la teneur en antibiotique du médicament pour évaluer l'effet antibactérien du médicament. De plus, le HPLC peut également être utilisé pour déterminer la concentration de médicaments dans les organismes, tels que le plasma, l'urine, les tissus et d'autres échantillons biologiques, pour évaluer l'efficacité et les effets indésirables des médicaments.
HPLC joue également un rôle important dans l'évaluation de la qualité des médicaments. En comparant les données analytiques de différents lots de médicaments, il est possible d'évaluer si la qualité des médicaments est stable. De plus, le HPLC peut également être utilisé pour étudier l'efficacité et les caractéristiques pharmacocinétiques des nouveaux médicaments, fournissant une base scientifique pour le développement et la commercialisation de nouveaux médicaments. Par exemple, au stade du développement de nouveaux médicaments, l'absorption, la distribution, le métabolisme et l'excrétion de nouveaux médicaments chez les animaux peuvent être déterminés par le HPLC, afin de comprendre l'efficacité et les caractéristiques pharmacocinétiques des nouveaux médicaments, et apporter un fort soutien pour les essais cliniques et les applications de commercialisation de nouveaux médicaments.
Les médicaments chiraux se réfèrent aux molécules de médicament avec des centres chiraux, et leurs énantiomères peuvent varier considérablement dans l'activité, le métabolisme et la toxicité. Par conséquent, il est d'une grande importance d'isoler et de déterminer les énantiomères des médicaments chiraux. Cette chromatographie joue un rôle important dans l'analyse des médicaments chiraux. En introduisant une phase stationnaire chirale ou un additif de phase mobile chirale, les énantiomères de médicament chiral peuvent être séparés et déterminés efficacement. Par exemple, pour les médicaments d'acides aminés optiquement actifs, différents énantiomères peuvent être séparés et déterminés par cette chromatographie pour évaluer l'activité biologique et la toxicité du médicament.
Les médicaments naturels proviennent d'un large éventail de sources avec des compositions complexes et peuvent contenir une variété de composés bioactifs. La chromatographie sur colonne joue un rôle important dans l'analyse des médicaments naturels. En optimisant des conditions chromatographiques et en sélectionnant une phase mobile appropriée, une séparation efficace et une détermination des composants actifs dans les médicaments naturels peuvent être réalisés. Par exemple, cette méthode de chromatographie a été utilisée pour séparer et déterminer les composantes actives de la médecine chinoise à base de plantes, telles que les flavonoïdes et les saponines, pour comprendre leurs types et leurs contenus, et pour fournir un fort soutien pour le contrôle de la qualité, le développement et l'utilisation de la médecine chinoise à base de plantes.
Avantages et défis de la chromatographie sur la colonne HPLC dans l'analyse des médicaments
La méthode chromatographique présente les avantages d'une efficacité de séparation élevée, d'une sensibilité élevée, d'une large plage d'applications et d'un degré élevé d'automatisation dans l'analyse des médicaments. Cependant, en application pratique, il fait également face à certains défis. Par exemple, le prétraitement de l'échantillon est très exigeant pour assurer la pureté et la stabilité de l'échantillon; Des coûts analytiques élevés, y compris l'acquisition d'instruments, la maintenance, la consommation de phase chromatographique et mobile; De plus, pour certains composants avec une forte polarité ou un gros poids moléculaire, le HPLC peut ne pas être en mesure de se séparer ou de détecter complètement. Par conséquent, dans les applications pratiques, la méthode d'analyse la plus appropriée doit être sélectionnée en fonction des exigences de qualité des médicaments spécifiques et de la situation réelle.
Perspectives futures
Avec les progrès de la science et de la technologie et le développement de la technologie de chromatographie liquide à haute performance, son application dans l'analyse des médicaments sera plus large. D'une part, le développement de nouveaux matériaux de phase stationnaire élargira considérablement la plage d'application de la chromatographie liquide à haute performance et améliorera l'efficacité et la sélectivité de séparation. D'un autre côté, les instruments HPLC seront plus intelligents et automatisés, surveillant l'état de la colonne en temps réel via des capteurs intégrés, permettant la maintenance prédictive, la réduction des temps d'arrêt et l'optimisation des processus expérimentaux. De plus, combiné avec la technologie d'analyse des mégadonnées, le système peut automatiquement ajuster les paramètres de fonctionnement pour correspondre aux meilleures conditions de séparation de différents échantillons, améliorant l'efficacité expérimentale et la fiabilité des résultats. Ces avancées fourniront des outils analytiques plus efficaces, précis et fiables pour l'analyse des médicaments, ce qui stimule le développement de la découverte de médicaments et du contrôle de la qualité.
En résumé, ce type de chromatographie joue un rôle important dans l'analyse des médicaments et a de larges perspectives d'application. En optimisant continuellement les conditions chromatographiques, en sélectionnant des phases mobiles et stationnaires appropriées, en introduisant de nouvelles technologies et équipements de détection, en améliorant davantage sa précision et sa fiabilité dans l'analyse des médicaments et en fournissant un soutien plus puissant pour le développement de médicaments, le contrôle de la qualité et la consommation clinique de médicaments.
Mérites et démérites
Avantage
Séparation efficace
La chromatographie sur la colonne HPLC utilise une pompe à perfusion à haute pression et une phase stationnaire à haute efficacité, ce qui rend l'efficacité des colonnes beaucoup plus élevée que la chromatographie liquide classique, et peut réaliser une séparation efficace des mélanges complexes.
Forte sensibilité
Équipé de détecteurs à haute sensibilité, tels que des détecteurs ultraviolets, des détecteurs de fluorescence, etc., peuvent détecter de faibles concentrations d'échantillons, ce qui est particulièrement important pour l'analyse des traces.
Largement utilisé
Il n'est pas limité par la volatilité et la stabilité thermique de l'échantillon, et peut analyser la matière organique avec un point d'ébullition élevé, une mauvaise stabilité thermique et une grande masse moléculaire relative, et possède une large gamme d'applications.
Bonne sélection
Il existe de nombreux types de phase mobile, et la sélectivité de la séparation peut être améliorée en modifiant le type et la composition de la phase mobile pour répondre aux exigences analytiques de différents échantillons.
Haut degré d'automatisation
La plupart des instruments HPLC modernes sont équipés d'un échantillonneur automatique et d'un processeur de données, ce qui peut réaliser l'automatisation de l'analyse et améliorer l'efficacité de l'analyse.
La récupération des échantillons est facile
L'échantillon n'est pas détruit après avoir traversé la colonne et un seul composant peut être collecté ou préparé, ce qui est pratique pour les expériences ou applications ultérieures.
Défaut
Le prix et les coûts de maintenance quotidienne des chromatographies liquides sont élevés, notamment le remplacement des colonnes, la consommation de phase mobile et l'étalonnage régulier de l'instrument.
Bien que plus rapide que la chromatographie liquide classique, les temps d'analyse HPLC sont encore relativement longs par rapport à la chromatographie en phase gazeuse, en particulier pour la séparation et l'analyse d'échantillons complexes.
Bien que les instruments HPLC soient hautement automatisés, le fonctionnement et la maintenance des instruments nécessitent toujours un certain niveau d'expertise et d'expérience. De plus, le prétraitement des échantillons peut être compliqué.
En raison de l'adsorption irréversible de certains composés sur la phase stationnaire, ces composés peuvent ne pas être détectés efficacement, affectant ainsi la précision de l'analyse.
La séparation de LC est souvent fortement influencée par la température de la colonne, et des conditions de température cohérentes doivent être maintenues afin d'obtenir des résultats reproductibles, ce qui augmente la complexité et le coût de l'expérience.
Précautions dans la détermination du contenu médicament
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Cette méthode présente de nombreuses précautions pour la détermination de la teneur en médicament, ce qui est très important pour garantir la précision et la fiabilité des résultats de détermination. Voici quelques considérations clés:
La différence de la colonne affectera le comportement de rétention du médicament, même si la longueur de la colonne, le diamètre intérieur, la taille des particules de la même colonne, en raison des différentes propriétés du remplissage, le temps de rétention et le type de pic du médicament peuvent être très différents. Par conséquent, la colonne appropriée doit être sélectionnée en fonction des propriétés du médicament et des besoins de séparation.
La colonne doit être maintenue régulièrement pour éviter la contamination et le blocage pour assurer ses bonnes performances de séparation.
Le pH du sel tampon de la phase mobile a un effet significatif sur le comportement de rétention des médicaments et peut même changer l'ordre de pointe de certains médicaments. Par conséquent, lors de l'optimisation de la phase mobile, une attention particulière doit être accordée à la valeur du pH du sel tampon.
La composition de la phase mobile affecte également l'effet de séparation du médicament. Par exemple, dans la détermination des préparations multivitamines, les changements dans le rapport relatif de l'hexanesulfonate de sodium et de l'heptane sulfonate de sodium dans la phase mobile affecteront le temps de rétention et la forme de pic de chaque composant. Par conséquent, la composition de phase mobile appropriée doit être sélectionnée en fonction de la nature du médicament et des besoins analytiques.
Le processus de traitement des échantillons doit assurer la représentativité et la stabilité de l'échantillon pour éviter la dégradation ou la contamination de l'échantillon pendant le traitement.
Lors de la pesée de l'échantillon, la méthode additive doit être utilisée pour la peser en place en même temps pour assurer la précision de la pesée. Dans le même temps, l'opération de pesée doit être standardisée pour éviter les fuites.
La qualité de la substance de référence a une influence directe sur le résultat de la détermination du contenu. Par conséquent, la qualité d'un contenu fiable et précis doit être sélectionnée.
Les produits de contrôle doivent être stockés comme requis pour éviter la dégradation ou la contamination. Si le produit de contrôle est conservé au réfrigérateur, il doit être réchauffé dans le four de séchage avant de peser.
Le type de détecteur approprié doit être sélectionné en fonction de la nature du médicament et des besoins analytiques, tels que le détecteur ultraviolet, le détecteur de fluorescence, etc.
Le détecteur doit être calibré périodiquement pour garantir la précision de ses résultats de mesure.
Analyse statistique raisonnable des données de mesure pour assurer la fiabilité et la répétabilité des résultats. Par exemple, l'écart type relatif (RSD) de la zone de pic peut être calculé pour évaluer la précision des résultats de mesure.
Lors du calcul du contenu, des méthodes fiables telles que les normes externes ou internes doivent être utilisées et la linéarité de la courbe standard doit être assurée.
Lors de l'établissement d'une nouvelle méthode de détermination du contenu, la vérification méthodologique doit être effectuée, y compris la spécificité, la linéarité, la plage, la précision, la précision, la durabilité, etc.
La vérification méthodologique est un moyen important pour s'assurer que la méthode de mesure est scientifique, raisonnable et fiable.
Assurez-vous que l'instrument reste stable pendant le processus d'analyse, en particulier lors de l'analyse multi-broches, faites attention pour observer si la valeur de réponse et la forme maximale de l'instrument sont stables.
Si des données anormales se produisent pendant le processus d'analyse, elles doivent être soigneusement vérifiées et éliminées, et réanalysées si nécessaire.
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